1
VŠCHT Praha,
2
Ústav molekulární genetiky AVČR,
3
Zentiva a.s., Praha Cílená molekulární léčba se může stát reálným novým přístupem k inhibici genové exprese na úrovni transkripce a translace. Genová terapie se zabývá základními metodami a směry rozvoje prostředků genové terapie se zaměřením na oligonukleotidy zprostředkovanou genovou terapii.
Základní schéma antisense a antigen terapie, spočívající v zablokování přenosu škodlivé informace z mRNA nebo DNA vypadá velmi přímočaré, ale praktická aplikace naráží na řadu zásadních problémů. Tím je především efektivní transport
oligodeoxyribonukleotidu (ODN) do buňky a dále vnitrobuněčná stabilita ODN. Úspěšné nalezení transportních systémů pro ODN rozhodne o tom, zda se skutečně stanou významných lékem budoucnosti.
Syntetické antisense oligodeoxyribonukleotidy (ODN) mohou být použity jako sekvenčně specifické inhibitory virální a buněčné genové exprese. Funkční účinnost ODN kriticky závisí na výběru cílové sekvence a efektivní vnitrobuněčné koncentraci. Ta je závislá na transportu do buňky, vnitrobuněčné distribuci, a stabilitě ODN v buněčném prostředí. Transport ODN přes buněčnou membránu do požadované buněčné organely představuje jednu z největších obtíží antisense strategie. Polyanionické a hydrofilní ODN nemohou difundovat skrz buněčnou membránu ale jsou aktivně přijímány buňkami za pomoci endocytosy zprostředkované receptory a pinocytosy v kapalné fázi.
Oba tyto procesy jsou však spíše neúčinné. Bylo provedeno mnoho různých pokusů zlepšit transport ODN do cytoplasmy a/nebo do jádra. I přes současné zlepšení transportu ODN do buněk v kultuře je terapie založená na nukleových kyselinách stále často omezena slabým průnikem nukleových kyselin do cytoplasmy a jader buněk. Dnes většina široce používaných a úspěšných přístupů zahrnuje komplexaci ODN s kationickými lipidy, které zvyšují jak pohlcení buňkou tak i aktivitu ODN.
Současný pohled na antisense a antigen terapii. Nedávné zprávy o ukončení významné etapy práce na poznání úplné mapy lidského genomu zvýšily opět zájem o možnost využití nových poznatků genetiky k léčení dědičných chorob a alespoň některých zhoubných nádorů.
U nádorů se rýsují zatím dvě cesty: přímé ovlivnění nádorové buňky nebo ovlivnění prostředí, v němž k nádorové proliferaci dochází. Při první cestě může být částečná náprava škod, způsobených změnami v genomu, podmiňujících dysregulaci buněčného cyklu a potom i autonomní nádorové bujení, uskutečněna genově terapeutickými postupy. Onkogeny mohou být zablokovány antisense oligodeoxyribonukleotidy, které jsou komplementární k sekvenci cílové RNA.
Nejdůležitějším představitelem inhibitorů genové exprese jsou tzv. antisense a antigen oligonukleotidy (ASO), cílené na jadernou DNA, cytoplazmatickou mRNA, ribosomy a proteiny spojované s DNA.
Transportní techniky pro ODN: Viral/bacterial vehicles: - Využívají geneticky modifikované viry a bakterie
Hodně nadějí bylo vloženo do transportních virálních systémů. Nakonec, to je to, co viry dělají přirozeně - vkládají své geny do cílových buněk. Jsou dvě třídy virů které vypadají slibně - retroviry a adenoviry. Nosiče vektoru mají složitý úkol: musí doručit geny buňkám pro dosažení antisense, nebo antigen efektu a sami musí zůstat nerozpoznány imunitním systémem.
Non-viral/bacterial vehicles: - Využívají katonické lipidy, biokomapatibilní polymery, liposomy, konjugáty ODN s cílenými proteiny (např. MAb)
- Anorganické nosiče, např. fosforečnan vápenatý
- Mechanické metody, např. elektroporace a aplikace pomocí genových pušek
Základní požadavky pro úspěch výše uvedených postupů jsou následující: - Cílený transport (buněčný, tkáňový)
- Účinný, efektivní transport do buněk
- Disociace transportního komplexu: ODN-transportér a nalezení intracelulárního cíle (DNA, mRNA)
- Pro antigenovou terapii dále je nutný transport z cytoplasmy do jádra
- Vlastní zabránění genové exprese
Z výše uvedeného je zřejmé, že požadavek na transportní systém, který by vyhovoval všem výše uvedeným požadavkům je velmi vysoký.
Z hlediska efektivity transportu jsou nejúčinnější virální vektory, ale ty žel mají řadu potenciálním problémů (imunitní reakce, vyvolání vedlejších účinků).
A tak budoucnost zřejmě patří dobře navrženým syntetickým nosičům.
Naše experimenty stejně tak jako práce z jiných pracovišť však ukazují, že primární leukemické buňky jsou resistentní vůči transportu ODN pomocí kationických lipidů. Je tedy potřeba najít účinný nosič, který by dopravil ODN do těchto buněk. Porfyrinové deriváty vykázaly slibné vlastnosti v této věci.
Náš projekt spočíval ve vývoji nových transportních systémů pro ODN transport do primárních leukemických buněk. Protože běžně dostupné kationické lipidy neposkytovaly očekávaný transportní efekt, vyvinuli jsme sérii nových makrocyklických kationických transportních systémů a identifikovali dva porfyrinové deriváty, které poskytovaly jak velmi dobrou transportní účinnost, tak výrazně zvyšovaly intracelulární stabilitu ODN. Dokladem úspěšného antisense postupu byla téměř úplná cílená inhibice exprese onkoproteinu v-myb.
Literatura:
Synthesis and Biolocalization of Water-Soluble Sapphyrins Král V., Sessler J.L.: J. Med. Chem. 2002, 45, 1073
Novel Cationic Transport Agents for ODN Delivery into Primary Leukemic Cells Králová J., Dvořák M., Král V.: J. Med. Chem. 2003, 46, 2049-2056